Darnley bị sát hại tám tháng sau khi James chào đời. Ngày 9 tháng 2 năm 1567, thi thể của ông và người hầu của ông đã được phát hiện tại Kirk o'Field, ở Edinburgh, nơi họ đang trú ngụ.

Trong vài tuần trước khi chết, Darnley đang dần hồi phục từ căn bệnh đậu mùa (hoặc, như nhiều người suy đoán, là bệnh giang mai). Ông được miêu tả là có những vết biến dạng trên khuôn mặt và thân thế. Ông ở với gia đình tại Glasgow, cho đến khi Mary đưa ông đến chữa trị tại Kirk o' Field, ngôi nhà hai tầng trong một nhà thờ tứ giáng, cách quãng đường đi bộ ngắn từ Holyrood – với mục đích là đưa ông vào triều một lần nữa.[28] Darnley ở lại Kirk o' Field trong khi Mary đến dự lễ cưới của Bastian Pagez, một trong những người hầu thân cận của bà, tại Holyrood. Khoảng 2 giờ tối ngày 10 tháng 2, 1567, trong khi Mary đi vắng, hai vụ nổ xảy ra phá tan Kirk o' Field. Nguyên nhân của hai vụ nổ về sau được cho là do hai thùng thuốc súng ở căn phòng nhỏ gần chỗ ngủ của Darnley. Thi thể của Darnley và người hầu William Taylor, được tìm thấy bên ngoài, được bọc bởi một chiếc áo choàng, một con dao găm, một cái ghế và một chiếc áo khác. Darnley chỉ mặc độc một chiếc áo ngủ, chúng tỏ là ông đã trốn đi vội vàng từ giường ngủ của mình. Sau khi kiểm tra kỹ hơn, người ta xác nhận không có dấu hiệu của sự tổn thương từ vụ nổ, do đó, vụ nổ đã không được coi là nguyên nhân làm Darnley chết. Kết luận là hai người đã bị giết bằng cách làm cho nghẹt thở, sự kiện này đã xảy ra sau vụ nổ. (Tuy nhiên, y học hiện đại công nhận rằng chấn thương bên trong có thể giết chết nạn nhân vụ nổ mà không có dấu hiệu của chấn thương bên ngoài.)